卵巢癌细胞对顺铂耐药机制的研究
作者：陈葳，李旭，杨玉琮，程小丽，牛映斗
单位：西安医科大学第一附属医院临床分子生物学中心(西安，710061)
关键词：卵巢癌细胞株；顺铂；药物耐受性
癌症990614
【摘要】目的：探明卵巢癌对顺铂产生耐药的机理。方法：采用顺铂体外诱导法建立卵巢癌耐药细胞株HO-8910/2。MTT法测定其耐药倍数和交叉耐药性，原子吸收法测定细胞内Pt浓度，分光光度法测定GSH、GST，流式细胞仪分析细胞周期，检测bcl-2和P-GP的表达。结果：HO-8910/2耐顺铂是亲代细胞HO-8910的6.6倍，与5-FU，ADR有交叉耐药性。对照亲代细胞，耐药细胞中GSH含量与GST活性明显增高，细胞G2/M比例增加，细胞内铂(Pt)摄入和蓄积减少，bcl-2表达阳性细胞增多，P-GP无变化。结论：细胞内药物浓度下降、bcl-2的表达增加、GSH与GST对铂化合物解毒作用的增强可能是HO-8910/2耐药机制形成的主要原因。
, http://www.100md.com
中图分类号：R737.31 文献标识码：A文章编号：1000-467X(1999)06-0674-03
Experimental study on the mechanism of cisplatin resistance in human
ovarian carcinoma cells
CHEN Wei，LI Xu，YANG Yu-cong，et al.
Center for Clinical Molecular Biology，the First Affiliated Hospital of X i’an Medical University. Xi’an 710061，P.R.China
【Abstrct】 Objective： To explore the mechanism of cisplatin resistance in human ovarian cancer.Methods：A cisplatin resistant human ovarian cancer cell line， HO-8910/2，was developed in vitro after prolonged drug exposure of the cisplatin-sensitive parental HO-8910 cell line. Drug cytotoxicities were determined using the micro tetrazolium assay. The concentrations of cellular Pt were determined by atomic absorption and the levels of cellular GSH and GST by were detected spectrophotometry. Cells cycle and expression of bcl-2 and P-gp were analysed by flow cytometry.Results：HO-8910/2 cell line exhibited a degree of resistance of approximately 6.6times compared with the parental cell line following 48h exposure to the drugs and was cross-resisance to 5-FU and VCR. A 44.1% reduction was observed in platinum accumulation in the selected cells after culturing with CDDP for two hours. Increased levels of cellular glutathione and glutathione S-transferase were found in the cisplatin-resistant cells with the results of GSH(μ mol/ml) 17.63± 2.00vs 15.63± 1.70 (P< 0.05) and GST (IU/ml) 9.67± 2.05 vs 5.33± 1.70 (P<0.01)，respectively.HO-8910/2 cells revealed a high percent of G2/M and an overexpressed bcl-2 protein (75.9% vs 34.4%)，but there was no difference in P-gp expression between the two cell lines. Conclusins：It is demonstrated that decreased drug accumulation，reduced susceptibility to cisplatin-induced apoptosis and increased content of intracellular glutathione and activity of glutathione S-transferase may contribute to the development of cellular resistance in the HO-8910/2 cells. The resistance is not related to the multidrug resistant system.
, 百拇医药
Key words：Ovarian carcinoma cell line;Cisplatin;Drug resistance
顺铂是治疗卵巢癌有效的药物。对顺铂产生耐药性是影响卵巢癌以顺铂为主的联合化疗方案治疗效果的一个重要原因〔1〕。Gately〔2〕和梁正东〔3〕通过建立耐顺铂的卵巢癌细胞模型，发现顺铂耐药与多种因素有关。为了进一步探明卵巢癌细胞对顺铂耐药的原因，我们为此建立了一株人卵巢癌耐顺铂细胞株，并从不同角度探讨了其耐药的发生机理。
1材料与方法
1.1材料
人卵巢癌HO-8910细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库，K562/ADR为本室诱导建立。顺铂(CDDP)由济南齐鲁制药厂生产，FITC标记的抗人bcl-2单抗为Dako公司产品，PE标记的抗P-GP单抗系Immunotech公司产品。
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1.2建株过程
将HO-8910细胞培养在RPMI-1640培养基中，内含10%新生小牛血清及100u/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素。从0.1μg/mlCDDP开始，逐渐增加剂量，最终使HO-8910细胞能持续生存于2.0μg/mlCDDP的环境中，并可以传代培养，将该细胞命名为HO-8910/2。以下所有实验均在撤药二周后的一周内完成。
1.3耐药指数及交叉耐药性检测
取指数生长期的亲代细胞HO-8910与耐药的细胞HO-8910/2，接种于96孔板，细胞浓度为5×104/孔，分别与不同浓度梯度的5-FU、VCR、ADR、CDDP培养48小时，每个浓度设四个复孔。MTT染色，酶标仪测OD值。通过药物浓度曲线求出耐药指数。
1.4细胞内铂(Pt)浓度测定
, 百拇医药
将亲代及耐药细胞接种于25ml培养瓶中，24小时后加入100μg/ml的CDDP，37℃，5%CO2培养箱孵育2小时，撤药，依次取撤药后0，2，8，12小时的细胞，将其制成细胞匀浆，原子吸收法测定细胞内Pt浓度。
1.5细胞GSH及GST的测定
按文献〔4，5〕法测定亲代和耐药细胞的GSH含量及GST活力。
1.6细胞周期分析
取指数生长期的亲代和耐药细胞，调整细胞数量为2×106/ml，经碘化丙啶(PI)染色，用流式细胞仪(EPICSELITE，Coulter，USA)分析细胞周期及DNA含量。
1.7细胞P-GP表达
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取2×106/mlHO-8910、HO-8910/2和K562/ADR的指数生长期细胞将它们各自分成两管，分别标记IgG2a-PE(阴性对照)和P-GP-PE。流式细胞仪检测亲代和耐药细胞阳性细胞的百分比。
1.8细胞bcl-2的表达
FITC标记的抗bcl-2单抗标记2×106/ml亲代和耐药的卵巢癌细胞，分别以IgG1-FITC标记的HO-8910及HO-8910/2为阴性对照，流式细胞仪检测阳性细胞百分比。
2结果
2.1交叉耐药及耐药指数
将亲代及耐药细胞分别与不同浓度梯度的5-FU，VCR，ADR，CDDP作用48小时，测出HO-8910/2对顺铂的耐药指数为6.6，与5-FU，ADR的耐药指数分别是3.16和1.22，两种细胞对VCR的IC50相同。
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2.2细胞内Pt浓度
图1可看出HO-8910/2在与100μg/mlCDDP保温2小时后撤药，0时细胞内Pt浓度较HO-8910细胞低，仅是其的44.1%，其后一直保持较低水平。
图1 亲代和耐药细胞内Pt浓度
2.3细胞内GSH含量和GST活力
耐药细胞HO-8910/2的GSH含量为17.63±2.00和GST活力为9.67±2.05均高于亲代HO-8910细胞分别P<0.05和P<0.01(见表1)。
表1 亲代及耐药细胞GSH含量及GST活力
组别
, http://www.100md.com
n
HO-8910
HO-8910/2
P值
GSH(μmol/ml)
8
15.63±1.70
17.63±2.00
<0.05
GST(IU/ml)
8
5.33±1.70
, http://www.100md.com
9.67±2.05
<0.01
2.4细胞周期分析
图2可看出亲代与耐药细胞周期分布有所不同，耐药细胞HO-8910/2的G2/M期明显高于亲代HO-8910细胞，DNA指数无明显差异。
图2 亲代及耐药细胞的DNA组方图
左图：亲代细胞HO-8910
右图：耐药细胞HO-8910/2
2.5细胞P-GP和bcl-2表达
, 百拇医药 流式细胞仪测定亲代细胞的P-GP表达为4.4%，耐药细胞的P-GP表达4.0%，两组无显著性差异。亲代细胞HO-8910bcl-2阳性率为34.4%，耐药细胞HO-8910/2的阳性率为75.9%，明显高于亲代细胞(图3)。
图3 亲代HO-8910细胞和耐药
HO-8910/2细胞bcl-2表达
A：亲代细胞HO-8910
B：耐药细胞HO-8910/2
3讨论
我们将卵巢癌细胞持续培养在具有细胞毒性药物的环境中，获得了耐顺铂的卵巢癌细胞株。该细胞株对影响DNA的细胞毒性药物也有交叉耐药性，细胞周期G2/M期比例升高，提示细胞对细胞毒性药物与DNA作用后的反应可能决定着细胞的化疗药物敏感性〔6〕。顺铂进入细胞后可通过细胞内钙离子变化，诱导人卵巢癌细胞凋亡〔7〕，当细胞不能对程序性死亡信号作出反应时，则表现出对细胞毒性处理不敏感，耐药的HO-8910/2细胞表达bcl-2明显高于敏感的HO-8910细胞也支持这一观点。另外，对耐药细胞株的药理学鉴定反映出药物蓄积减少。同时，细胞内硫醇类化合物，如谷胱甘肽增加。这些结果表明HO-8910/2细胞是一个与HO-8910细胞生物性状截然不同的多药耐药细胞株，并具备卵巢癌临床耐药复杂性的特点。
, http://www.100md.com
综合分析以上结果，我们认为HO-8910/2细胞耐药与以下因素有关：(1)Pt摄入、蓄积减少；以往的研究表明细胞内Na+、K+浓度及Na+/K+ATP酶、蛋白激酶C、蛋白激酶A以及c-Ha-ras基因的过表达均能影响细胞Pt的摄入、蓄积〔2〕。(2)GSH解毒系统参与；GSH通过与细胞毒因子形成螯合物达到其解毒功能。GST(Glutathione S-Transferase)是存在于细胞浆内的多功能蛋白质，它催化GSH与细胞因子的结合过程。Green〔8〕在1993年就发现GSH含量的增加和GST活力的增强与化疗耐药呈正相关。(3)抗细胞凋亡因子的参与；bcl-2是一个抗细胞凋亡的基因。Eliopoulous〔9〕在研究卵巢癌耐药和凋亡调控时发现bcl-2高表达是卵巢癌细胞耐药的重要原因。也就是说，凋亡途径的异常是肿瘤细胞产生耐药的重要机制。HO-8910/2细胞的建立将为今后研究非P-GP耐药细胞的逆转提供了很好的细胞学模型。
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〔参考文献〕
〔1〕Perez RP，Hamilton TC，Ozols RF，et al.Mechanisms and modulation of resistance to chemotherapy in ovarian cancer〔J〕.Cancer，1993，71：1571～1580.
〔2〕Gately DP，Howell SB.Cellular accumlation of anticancer agent cisplatin：a review〔J〕.Br J Cancer,1993，67：1171～1176.
〔3〕梁正东，卞度宏.卵巢癌细胞对顺铂耐药及其逆转的实验研究〔J〕.中华妇产科杂志，1996，31：75～78.
〔4〕夏奕明，朱莲珍.血和组织中谷胱甘肽过氧化物酶活力测定方法〔J〕.卫生研究,1987，16：29～32.
, 百拇医药
〔5〕王文学，周四元，李文丽.血清谷胱甘肽S-转移酶分光光度测定法〔J〕.第四军医大学学报,1997，18：2412～243.
〔6〕Perego P， Giarola M， Rifhetti SC，et al.Association between cisplatin resistance and mutation of p53 gene and reduced bax expression in ovarin carcinoma cell systems〔J〕. Cancer Res，1996，56：556～562.
〔7〕刘勤，陈葳，李旭，等.顺铂诱导人卵巢癌AO10/17细胞凋亡的实验研究〔J〕.中华妇产科杂志，1998，33：422～424.
〔8〕Green JA，Robertson LJ，Clark AH. Gluitathione S-transferase expression in benign and maligmant ovarian tumors〔J〕.Br J Cancer，1993，68：235～239.
〔9〕Eliopoulos AG， Kerr DJ， Herod J， et al.The control of apoptosis and drug resistance in ovarian cancer： influence of p53 and bcl-2〔J〕.Oncogene，1995，11：1217～1228.
收稿日期：1999-01-21；修回日期：1999-04-27, 百拇医药
单位：西安医科大学第一附属医院临床分子生物学中心(西安，710061)
关键词：卵巢癌细胞株；顺铂；药物耐受性
癌症990614
【摘要】目的：探明卵巢癌对顺铂产生耐药的机理。方法：采用顺铂体外诱导法建立卵巢癌耐药细胞株HO-8910/2。MTT法测定其耐药倍数和交叉耐药性，原子吸收法测定细胞内Pt浓度，分光光度法测定GSH、GST，流式细胞仪分析细胞周期，检测bcl-2和P-GP的表达。结果：HO-8910/2耐顺铂是亲代细胞HO-8910的6.6倍，与5-FU，ADR有交叉耐药性。对照亲代细胞，耐药细胞中GSH含量与GST活性明显增高，细胞G2/M比例增加，细胞内铂(Pt)摄入和蓄积减少，bcl-2表达阳性细胞增多，P-GP无变化。结论：细胞内药物浓度下降、bcl-2的表达增加、GSH与GST对铂化合物解毒作用的增强可能是HO-8910/2耐药机制形成的主要原因。
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中图分类号：R737.31 文献标识码：A文章编号：1000-467X(1999)06-0674-03
Experimental study on the mechanism of cisplatin resistance in human
ovarian carcinoma cells
CHEN Wei，LI Xu，YANG Yu-cong，et al.
Center for Clinical Molecular Biology，the First Affiliated Hospital of X i’an Medical University. Xi’an 710061，P.R.China
【Abstrct】 Objective： To explore the mechanism of cisplatin resistance in human ovarian cancer.Methods：A cisplatin resistant human ovarian cancer cell line， HO-8910/2，was developed in vitro after prolonged drug exposure of the cisplatin-sensitive parental HO-8910 cell line. Drug cytotoxicities were determined using the micro tetrazolium assay. The concentrations of cellular Pt were determined by atomic absorption and the levels of cellular GSH and GST by were detected spectrophotometry. Cells cycle and expression of bcl-2 and P-gp were analysed by flow cytometry.Results：HO-8910/2 cell line exhibited a degree of resistance of approximately 6.6times compared with the parental cell line following 48h exposure to the drugs and was cross-resisance to 5-FU and VCR. A 44.1% reduction was observed in platinum accumulation in the selected cells after culturing with CDDP for two hours. Increased levels of cellular glutathione and glutathione S-transferase were found in the cisplatin-resistant cells with the results of GSH(μ mol/ml) 17.63± 2.00vs 15.63± 1.70 (P< 0.05) and GST (IU/ml) 9.67± 2.05 vs 5.33± 1.70 (P<0.01)，respectively.HO-8910/2 cells revealed a high percent of G2/M and an overexpressed bcl-2 protein (75.9% vs 34.4%)，but there was no difference in P-gp expression between the two cell lines. Conclusins：It is demonstrated that decreased drug accumulation，reduced susceptibility to cisplatin-induced apoptosis and increased content of intracellular glutathione and activity of glutathione S-transferase may contribute to the development of cellular resistance in the HO-8910/2 cells. The resistance is not related to the multidrug resistant system.
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Key words：Ovarian carcinoma cell line;Cisplatin;Drug resistance
顺铂是治疗卵巢癌有效的药物。对顺铂产生耐药性是影响卵巢癌以顺铂为主的联合化疗方案治疗效果的一个重要原因〔1〕。Gately〔2〕和梁正东〔3〕通过建立耐顺铂的卵巢癌细胞模型，发现顺铂耐药与多种因素有关。为了进一步探明卵巢癌细胞对顺铂耐药的原因，我们为此建立了一株人卵巢癌耐顺铂细胞株，并从不同角度探讨了其耐药的发生机理。
1材料与方法
1.1材料
人卵巢癌HO-8910细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库，K562/ADR为本室诱导建立。顺铂(CDDP)由济南齐鲁制药厂生产，FITC标记的抗人bcl-2单抗为Dako公司产品，PE标记的抗P-GP单抗系Immunotech公司产品。
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1.2建株过程
将HO-8910细胞培养在RPMI-1640培养基中，内含10%新生小牛血清及100u/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素。从0.1μg/mlCDDP开始，逐渐增加剂量，最终使HO-8910细胞能持续生存于2.0μg/mlCDDP的环境中，并可以传代培养，将该细胞命名为HO-8910/2。以下所有实验均在撤药二周后的一周内完成。
1.3耐药指数及交叉耐药性检测
取指数生长期的亲代细胞HO-8910与耐药的细胞HO-8910/2，接种于96孔板，细胞浓度为5×104/孔，分别与不同浓度梯度的5-FU、VCR、ADR、CDDP培养48小时，每个浓度设四个复孔。MTT染色，酶标仪测OD值。通过药物浓度曲线求出耐药指数。
1.4细胞内铂(Pt)浓度测定
, 百拇医药
将亲代及耐药细胞接种于25ml培养瓶中，24小时后加入100μg/ml的CDDP，37℃，5%CO2培养箱孵育2小时，撤药，依次取撤药后0，2，8，12小时的细胞，将其制成细胞匀浆，原子吸收法测定细胞内Pt浓度。
1.5细胞GSH及GST的测定
按文献〔4，5〕法测定亲代和耐药细胞的GSH含量及GST活力。
1.6细胞周期分析
取指数生长期的亲代和耐药细胞，调整细胞数量为2×106/ml，经碘化丙啶(PI)染色，用流式细胞仪(EPICSELITE，Coulter，USA)分析细胞周期及DNA含量。
1.7细胞P-GP表达
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取2×106/mlHO-8910、HO-8910/2和K562/ADR的指数生长期细胞将它们各自分成两管，分别标记IgG2a-PE(阴性对照)和P-GP-PE。流式细胞仪检测亲代和耐药细胞阳性细胞的百分比。
1.8细胞bcl-2的表达
FITC标记的抗bcl-2单抗标记2×106/ml亲代和耐药的卵巢癌细胞，分别以IgG1-FITC标记的HO-8910及HO-8910/2为阴性对照，流式细胞仪检测阳性细胞百分比。
2结果
2.1交叉耐药及耐药指数
将亲代及耐药细胞分别与不同浓度梯度的5-FU，VCR，ADR，CDDP作用48小时，测出HO-8910/2对顺铂的耐药指数为6.6，与5-FU，ADR的耐药指数分别是3.16和1.22，两种细胞对VCR的IC50相同。
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2.2细胞内Pt浓度
图1可看出HO-8910/2在与100μg/mlCDDP保温2小时后撤药，0时细胞内Pt浓度较HO-8910细胞低，仅是其的44.1%，其后一直保持较低水平。
图1 亲代和耐药细胞内Pt浓度
2.3细胞内GSH含量和GST活力
耐药细胞HO-8910/2的GSH含量为17.63±2.00和GST活力为9.67±2.05均高于亲代HO-8910细胞分别P<0.05和P<0.01(见表1)。
表1 亲代及耐药细胞GSH含量及GST活力
组别
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n
HO-8910
HO-8910/2
P值
GSH(μmol/ml)
8
15.63±1.70
17.63±2.00
<0.05
GST(IU/ml)
8
5.33±1.70
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9.67±2.05
<0.01
2.4细胞周期分析
图2可看出亲代与耐药细胞周期分布有所不同，耐药细胞HO-8910/2的G2/M期明显高于亲代HO-8910细胞，DNA指数无明显差异。
图2 亲代及耐药细胞的DNA组方图
左图：亲代细胞HO-8910
右图：耐药细胞HO-8910/2
2.5细胞P-GP和bcl-2表达
, 百拇医药 流式细胞仪测定亲代细胞的P-GP表达为4.4%，耐药细胞的P-GP表达4.0%，两组无显著性差异。亲代细胞HO-8910bcl-2阳性率为34.4%，耐药细胞HO-8910/2的阳性率为75.9%，明显高于亲代细胞(图3)。
图3 亲代HO-8910细胞和耐药
HO-8910/2细胞bcl-2表达
A：亲代细胞HO-8910
B：耐药细胞HO-8910/2
3讨论
我们将卵巢癌细胞持续培养在具有细胞毒性药物的环境中，获得了耐顺铂的卵巢癌细胞株。该细胞株对影响DNA的细胞毒性药物也有交叉耐药性，细胞周期G2/M期比例升高，提示细胞对细胞毒性药物与DNA作用后的反应可能决定着细胞的化疗药物敏感性〔6〕。顺铂进入细胞后可通过细胞内钙离子变化，诱导人卵巢癌细胞凋亡〔7〕，当细胞不能对程序性死亡信号作出反应时，则表现出对细胞毒性处理不敏感，耐药的HO-8910/2细胞表达bcl-2明显高于敏感的HO-8910细胞也支持这一观点。另外，对耐药细胞株的药理学鉴定反映出药物蓄积减少。同时，细胞内硫醇类化合物，如谷胱甘肽增加。这些结果表明HO-8910/2细胞是一个与HO-8910细胞生物性状截然不同的多药耐药细胞株，并具备卵巢癌临床耐药复杂性的特点。
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综合分析以上结果，我们认为HO-8910/2细胞耐药与以下因素有关：(1)Pt摄入、蓄积减少；以往的研究表明细胞内Na+、K+浓度及Na+/K+ATP酶、蛋白激酶C、蛋白激酶A以及c-Ha-ras基因的过表达均能影响细胞Pt的摄入、蓄积〔2〕。(2)GSH解毒系统参与；GSH通过与细胞毒因子形成螯合物达到其解毒功能。GST(Glutathione S-Transferase)是存在于细胞浆内的多功能蛋白质，它催化GSH与细胞因子的结合过程。Green〔8〕在1993年就发现GSH含量的增加和GST活力的增强与化疗耐药呈正相关。(3)抗细胞凋亡因子的参与；bcl-2是一个抗细胞凋亡的基因。Eliopoulous〔9〕在研究卵巢癌耐药和凋亡调控时发现bcl-2高表达是卵巢癌细胞耐药的重要原因。也就是说，凋亡途径的异常是肿瘤细胞产生耐药的重要机制。HO-8910/2细胞的建立将为今后研究非P-GP耐药细胞的逆转提供了很好的细胞学模型。
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〔参考文献〕
〔1〕Perez RP，Hamilton TC，Ozols RF，et al.Mechanisms and modulation of resistance to chemotherapy in ovarian cancer〔J〕.Cancer，1993，71：1571～1580.
〔2〕Gately DP，Howell SB.Cellular accumlation of anticancer agent cisplatin：a review〔J〕.Br J Cancer,1993，67：1171～1176.
〔3〕梁正东，卞度宏.卵巢癌细胞对顺铂耐药及其逆转的实验研究〔J〕.中华妇产科杂志，1996，31：75～78.
〔4〕夏奕明，朱莲珍.血和组织中谷胱甘肽过氧化物酶活力测定方法〔J〕.卫生研究,1987，16：29～32.
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〔5〕王文学，周四元，李文丽.血清谷胱甘肽S-转移酶分光光度测定法〔J〕.第四军医大学学报,1997，18：2412～243.
〔6〕Perego P， Giarola M， Rifhetti SC，et al.Association between cisplatin resistance and mutation of p53 gene and reduced bax expression in ovarin carcinoma cell systems〔J〕. Cancer Res，1996，56：556～562.
〔7〕刘勤，陈葳，李旭，等.顺铂诱导人卵巢癌AO10/17细胞凋亡的实验研究〔J〕.中华妇产科杂志，1998，33：422～424.
〔8〕Green JA，Robertson LJ，Clark AH. Gluitathione S-transferase expression in benign and maligmant ovarian tumors〔J〕.Br J Cancer，1993，68：235～239.
〔9〕Eliopoulos AG， Kerr DJ， Herod J， et al.The control of apoptosis and drug resistance in ovarian cancer： influence of p53 and bcl-2〔J〕.Oncogene，1995，11：1217～1228.
收稿日期：1999-01-21；修回日期：1999-04-27, 百拇医药